Работая над «Битвой при Ангиари», Леонардо одновременно начал писать самый известный в истории живописи портрет — «Мона Лиза». В его дневнике нет ни единого упоминания о работе над портретом. Кто заказал картину? Кто был моделью Леонардо? Никаких документальных свидетельств художник не оставил. Самая популярная версия принадлежит Джорджо Вазари. В своем труде «Жизнеописания наиболее знаменитых живописцев, ваятелей и зодчих» он пишет: «Для Франческо дель Джокондо, богатого флорентийского торговца, Леонардо создал портрет Моны Лизы, его жены». Согласно другой версии, моделью была флорентийская дама, любовница герцога Джулиано Медичи. Еще одна кандидатка в героини полотна — герцогиня Мантуи Изабелла д'Эсте, приятельница художника. Некоторые исследователи утверждают, что никакой модели небыло вовсе и что Леонардо воплотил в «Джоконде» образ покойной матери. Наконец, очень популярна точка зрения, что «Мона Лиза» — автопортрет мастера.

Ряд историков искусства считают, что существует две разные картины Леонардо — «Мона Лиза» и «Джоконда». В 1505 году Рафаэль, гостивший у Леонардо, создал копию «Моны Лизы», где за спиной модели возвышается античная колонна. Но на известной нам версии картины никакой колонны нет. Поэтому есть вероятность того, что Леонардо написал два похожих женских портрета. Как бы то ни было, несомненно одно: для самого мастера картина была очень дорога. И в Милане, и в Риме, и в своем последнем прибежище, французском Амбуазе, он не расставался с ней.

Существует около 60 картин, названных «Мона Лиза», и с каждым годом этот список пополняется очередной находкой. Почти все они — копии учеников Леонардо. Однако если мастер действительно создал две версии этого портрета, то вполне возможно, что ее авторский вариант находится среди них. 

По завещанию «Мона Лиза» перешла к ученику Леонардо. Вскоре полотно выкупил последний покровитель художника, французский король Франциск I. Несколько поколений королей любовались «Джокондой» в Версале, пока Людовик XV не велел убрать ее в хранилище. После Великой французской революции по приказу Наполеона «Мону Лизу» поместили в его спальню во дворце Тюильри, а позднее — в музей Наполеона в Лувре. 21 августа 1911 года картину украли. Похитителем был итальянец Винченцо Перуджа. Он хотел вернуть полотно на родину Леонардо и почти три года прятал шедевр в собственном доме. После похищения «Мона Лиза» покидала Лувр всего дважды: в 1963 году картина выставлялась в США, в 1974 году — в Японии и СССР. В 1960 году «Мона Лиза» были помещена в пуленепробиваемый футляр и с тех его не покидала.  В настоящее время находится в Лувре.